Высокоошибочный синтез ДНК на клик-лигированных матрицах

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Клик-лигирование – метод соединения фрагментов ДНК, основанный на азид-алкиновом циклоприсоединении. В наиболее распространенном варианте клик-лигирование вводит 4-метил-1,2,3-триазольную группу (trz) вместо фосфодиэфирной связи между двумя нуклеозидами. Хотя такая связь считается биосовместимой, практически ничего не известно о возможности ее узнавания системами репарации ДНК или о потенциале блокирования и ошибок ДНК-полимераз. В работе показано, что trz-связь устойчива к нескольким эндонуклеазам, участвующим в репарации ДНК бактерий и человека. В то же время она сильно блокирует некоторые ДНК-полимеразы (Pfu, ДНК-полимераза β), но проходится другими (полимераза фага RB69, фрагмент Кленова). Все полимеразы, за исключением ДНК-полимеразы β, с высокой частотой ошибаются при прохождении trz-связи, включая dAMP вместо следующего комплементарного нуклеотида. Таким образом, от клик-лигирования можно ожидать низкой точности в технологиях генного синтеза.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

А. В. Ендуткин

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: dzharkov@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск

А. О. Яковлев

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Email: dzharkov@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск; Новосибирск

Т. Д. Жарков

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: dzharkov@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск

В. М. Голышев

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: dzharkov@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск

А. В. Юдкина

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: dzharkov@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск

Д. О. Жарков

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: dzharkov@niboch.nsc.ru

член-корреспондент РАН

Россия, Новосибирск; Новосибирск

Список литературы

  1. Rostovtsev V.V., Green L.G., Fokin V.V., et al. A stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective ligation of azides and terminal alkynes, Angew. Chem. Int. Ed., 2002, vol. 41, no. 14, pp. 2596–2599.
  2. Tornøe C.W., Christensen C., and Meldal M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-Triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides, J. Org. Chem. 2002, vol. 67, no. 9. pp. 3057–3064.
  3. Gierlich J., Burley G.A., Gramlich P.M.E., et al. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA, Org. Lett., 2006, vol. 8, no. 17, pp. 3639–3642.
  4. Seela F., and Sirivolu V.R. DNA containing side chains with terminal triple bonds: Base-pair stability and functionalization of alkynylated pyrimidines and 7-deazapurines, Chem. Biodivers., 2006, vol. 3, no. 5. pp. 509–514.
  5. El-Sagheer A.H., Sanzone A.P., Gao R., et al. Biocompatible artificial DNA linker that is read through by DNA polymerases and is functional in Escherichia coli, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 2011, vol. 108, no. 28, pp. 11338–11343.
  6. Sanzone A.P., El-Sagheer A.H., Brown T., and Tavassoli A. Assessing the biocompatibility of click-linked DNA in Escherichia coli, Nucleic Acids Res., 2012, vol. 40, no. 20, pp. 10567–10575.
  7. Dallmann A., El-Sagheer A.H., Dehmel L., et al. Structure and dynamics of triazole-linked DNA: Biocompatibility explained, Chemistry, 2011, vol. 17, no. 52, pp. 14714–14717.
  8. El-Sagheer A.H., and Brown T. New strategy for the synthesis of chemically modified RNA constructs exemplified by hairpin and hammerhead ribozymes, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 2010, vol. 107, no. 35, pp. 15329–15334.
  9. El-Sagheer A.H., and Brown T. Efficient RNA synthesis by in vitro transcription of a triazole-modified DNA template, Chem. Commun., 2011, vol. 47, no. 44, pp. 12057–12058.
  10. Rothwell P.J., and Waksman G. Structure and mechanism of DNA polymerases, Adv. Protein Chem., 2005, vol. 71, pp. 401–440.
  11. Endutkin A.V., Yudkina A.V., Zharkov T.D., et al. Recognition of a clickable abasic site analog by DNA polymerases and DNA repair enzymes, Int. J. Mol. Sci., 2022, vol. 23, no. 21, 13353.
  12. Ishchenko A.A., Ide H., Ramotar D., et al. α-Anomeric deoxynucleotides, anoxic products of ionizing radiation, are substrates for the endonuclease IV-type AP endonucleases, Biochemistry, 2004, vol. 43, no. 48, pp. 15210–15216.
  13. Du X., Yang Z., Xie G., et al. Molecular basis of the plant ROS1-mediated active DNA demethylation, Nat. Plants, 2023, vol. 9, no. 2, pp. 271–279.
  14. Shen J.-C., Creighton S., Jones P.A., and Goodman M.F. A comparison of the fidelity of copying 5-methylcytosine and cytosine at a defined DNA template site, Nucleic Acids Res., 1992, vol. 20, no. 19, pp. 5119–5125.
  15. Zahn K.E., Averill A., Wallace S.S., and Doublié S. The miscoding potential of 5-hydroxycytosine arises due to template instability in the replicative polymerase active site, Biochemistry, 2011, vol. 50, no. 47, pp. 10350–10358.
  16. Howard M.J., Foley K.G., Shock D.D., et al. Molecular basis for the faithful replication of 5-methylcytosine and its oxidized forms by DNA polymerase β, J. Biol. Chem., 2019, vol. 294, no. 18, pp. 7194–7201.
  17. Taylor J.-S. New structural and mechanistic insight into the A-rule and the instructional and non-instructional behavior of DNA photoproducts and other lesions, Mutat. Res., 2002, vol. 510, no. 1–2, pp. 55–70.
  18. Obeid S., Baccaro A., Welte W., et al. Structural basis for the synthesis of nucleobase modified DNA by Thermus aquaticus DNA polymerase, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 2010, vol. 107, no. 50, pp. 21327–21331.
  19. Xia S., Vashishtha A., Bulkley D. et al. Contribution of partial charge interactions and base stacking to the efficiency of primer extension at and beyond abasic sites in DNA, Biochemistry, 2012, vol. 51, no. 24, pp. 4922–4931.
  20. Beard W.A., Shock D.D., Batra V.K. et al. DNA polymerase β substrate specificity: Side chain modulation of the “A-rule”, J. Biol. Chem., 2009, vol. 284, no. 46, pp. 31680–31689.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. а – схема получения олигонуклеотида с триазольной межнуклеозидной связью и ее структура в сравнении с природной фосфодиэфирной связью. б – конформация trz-связи в сравнении с фосфодиэфирной связью по данным спектроскопии ядерного магнитного резонанса [7]. Приведено строение части немодифицированного ДНК-дуплекса (код структуры в базе данных Protein Data Bank 2KUZ, атомы углерода окрашены в белый цвет) и дуплекса с trz-связью (код 2L8I, атомы углерода окрашены в черный цвет).

Скачать (100KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Репрезентативный радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов расщепления 32Р-меченой цепи ДНК с trz-связью эндонуклеазами APE1 и Xth. Реакцию вели при 37°C в течение 1 ч в буфере, содержащем 20 мМ HEPES–KOH (pH 8.0), 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl2 либо CaCl2 либо 1 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 1 мМ дитиотреитол (DTT) и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина. Концентрация ДНК-субстрата составляла 50 нМ, ферментов – 1 мкМ APE1 либо 10 нМ Xth. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20%-ном полиакриламидном геле в присутствии 7 М мочевины и анализировали с помощью установки радиолюминесцентного сканирования Typhoon 9500 (GE Healthcare, США). М – смесь маркеров подвижности длиной 15, 16 и 33 нуклеотида (М15, M16 и M33, табл. 1; соответствующие полосы отмечены стрелками); оц – одноцепочечный ДНК-субстрат (33trz, табл. 1); дц – двуцепочечный ДНК-субстрат (33trz//T2, табл. 1).

Скачать (113KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Репрезентативные радиоавтографы гелей после электрофоретического разделения продуктов синтеза ДНК-полимеразами KF, RBpol, Pol β (а) и Pfu (б) на матрицах с trz-связью. Реакцию вели при 37°C в течение 10 мин (20 мин для Pfu) в буфере, содержащем 50 мМ Трис–HCl (pH 7.5), 5 мМ MgCl2 (для KF и RBpol) либо 10 мМ MgCl2 (для Pol β), 1 мМ DTT; либо 20 мМ Трис–HCl (pH 8.8), 10 мМ KCl, 10 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgSO4, 0.1 %-ный Тритон X-100 для Pfu. Концентрация ДНК-субстрата с 32P-меченым праймером составляла 50 нМ, dNTP – 500 мкМ (индивидуальные dNTP либо их эквимолярная смесь), ДНК-полимераз – 0.1 ед. акт./мкл (Pfu) либо 10 нМ (прочие полимеразы). Продукты реакции анализировали, как описано выше. P1, P2 – праймеры. Числа под изображениями отражают интенсивность полос, соответствующих включению хотя бы одного нуклеотида при прохождении через trz-связь (> n), одного нуклеотида с последующим удлинением (> n+1) и экзонуклеолитической деградации праймера (< n).

Скачать (165KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024