Laboratory of Peptide Chemistry, G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences: forty years of research on peptides and proteins of sea anemones

Full Text

Введение

Наземные и морские ядовитые организмы, как известно, являются одним из наиболее богатых источников разнообразных биологически активных соединений как белковой, так и небелковой природы, многие из которых обладают фармакологическим потенциалом. Поэтому в последние несколько десятилетий продуцируемые этими организмами соединения, в частности белковой природы, широко изучаются как перспективные терапевтические агенты [1, 2]. В ходе длительного эволюционного развития белковые структуры претерпели значительную диверсификацию, и многие из них, благодаря токсическому воздействию на организм-мишень (жертву или потенциального хищника), превратились в мощное средство защиты и нападения продуцирующего организма.

К наиболее известным морским ядовитым организмам принадлежит тип Cnidaria, который объединяет морские анемоны, медузы, кораллы [3]. Данные кишечнополостные, обитающие практически во всех водах Мирового океана, относятся к свободноплавающим (медузы) или ведущим прикрепленный к грунту образ жизни (морские анемоны, гидроидные полипы, кораллы). Как правило, они питаются планктоном, зоохлореллами, охотятся на маленьких моллюсков и рыбок. Характерной особенностью морских анемон является наличие щупалец, снабженных уникальным аппаратом нападения в виде специализированных стрекательных жалящих клеток, книдоцитов (или нематоцитов), которые служат морским анемонам в качестве орудия защиты от врагов и для добычи пищи. Книдоциты содержат специфические внутриклеточные органеллы (книдоцисты, или нематоцисты), снабженные ядовитым секретом, который и обеспечивает поражение врага или пищевого объекта. Именно необходимость в питании и защите от потенциальных хищников предопределила способность морских анемон производить сильнодействующие белковые токсины.

Надо сказать, что ядовитый секрет анемон является серьезным ограничением для дайверов, аквалангистов и туристов, поскольку внешний вид морских анемон, напоминающих прекрасные цветы, привлекает к контакту с ними подводных пловцов, в то время как прикосновение к этим животным чревато сильными ожогами и может вызвать сильнейшую аллергию или даже летальный исход. Изучение компонентов ядовитого секрета морских анемон на молекулярном уровне, главным образом токсинов (анемонотоксинов), началось только в 70-х годах прошлого века. Из нескольких тропических видов были выделены индивидуальные токсины, установлены их аминокислотные последовательности, и началось широкомасштабное исследование биологической активности и структурно-функциональных взаимосвязей, продолжающееся и по сей день. Этому способствует небывалый интерес к анемонотоксинам [1–3], а также другим белкам и пептидам морских анемон, которые, благодаря специфичности связывания с биологическими мишенями (ионными каналами и рецепторами, цитоплазматическими мембранами, протеолитическими ферментами и др.), являются незаменимыми биохимическими и молекулярными инструментами изучения функциональной активности и механизмов функционирования мишеней.

В этой юбилейной работе кратко изложены основные результаты сорокалетних структурно-функциональных исследований нативных пептидов и полипептидов – представителей нескольких структурных классов белковых соединений, продуцируемых морской анемоной H. crispa (нейротоксинов, актинопоринов, пептидов Кунитц-типа, APETx-подобных пептидов и дефензинов), а также их рекомбинантных аналогов, которые проведены методами белковой химии, биохимии, молекулярной и клеточной биологии, электрофизиологического тестирования и in vivo исследований, с привлечением протеомных подходов, а также методов молекулярного моделирования для установления пространственной организации и механизмов взаимодействия с мишенями. Для ряда пептидов обсуждается специфичность и фармакологический потенциал.

1. Исследование структуры и функциональной активности Radianthus (Heteractis) нейротоксинов

1.1. Аминокислотные последовательности

В 1984 г. автоматическим секвенированием по методу Эдмана впервые была установлена аминокислотная последовательность высокотоксичного нейротоксина RTX-III [4], а затем в течение нескольких лет последовательности еще четырех высокогомологичных нейротоксинов, RTX-I [5], RTX-II [6], RTX-IV и RTX-V [7] (рис. 1, а), различающихся величинами токсичности для млекопитающих и членистоногих. Данные последовательности, в отличие от последовательностей известных нейротоксинов морских анемон ATX-II (Anemonia sulcata), ApA, ApB (Anthopleura xanthogrammica) и др. [8], содержащих 1–2 заряженных остатка на C-конце молекул, имели по четыре таких остатка (рис. 1, б). Положение дисульфидных связей Radianthus нейротоксинов RTX-I–RTX-V соответствовало таковому всех вышеупомянутых нейротоксинов [8].

 

Рис. 1. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей нейротоксинов: структурного типа 2 – RTX-I (P30831) [5], RTX-II (P30783) [6], RTX-III (P30832) [4], RTX-IV (P30784) и RTX-V (P30785) [7] из H. crispa, Rp-II (P01534) из R. paumotensis [9], SHTX-IV (В1В519) [10] из Stichodactyla haddoni, Sh1 (З19651) [8, 11] из Stichodactyla helianthus (а); структурного типа 1 – ATX-II (P01528) [12] из Anemonia sulcata, ApA (P01530) [13], ApB (P01531) [14] из Anthopleura xanthogrammica (б). На сером фоне показаны идентичные аминокислотные остатки, на белом – точечные замены остатков в последовательностях, красным цветом – функционально значимый для связывания с Na_V остаток Arg13 [8]. Прямые линии в верхней части рисунка показывают соединение С1-С5, С2-С4, С3-С6 в дисульфидных мостиках между остатками цистеина (показаны жирным шрифтом). Элайнмент выполнен с помощью программы Vector NTI

 

Драматическим моментом для Radianthus токсинов RTX-I–RTX-V оказалось непризнание первичной структуры RTX-III французским исследователем Мишелем Лаздунским, корифеем в области структурной химии анемонотоксинов, первоначально не поверившим в структуру RTX-III, установленную в России. Однако позже научному сообществу пришлось признать достоверность полученных в ЛХП результатов и согласиться с существованием нового структурного типа 2 анемонотоксинов (NaTx), поскольку в последующие годы он пополнился представителями из других видов анемон [9–11] (рис. 1, а) и в настоящее время насчитывает 14 нейротоксинов [8], которые отличаются несколькими точечно локализованными по всей длине последовательности остатками от нейротоксинов структурного типа 1 (рис. 1, б) [12–14].

В настоящее время помимо структурных типов 1 и 2 нейротоксинов известно еще как минимум два типа, один из которых, тип 3 с несколькими представителями, относится к «коротким» (около 30 а.о.), а другой, тип 4, включает всего два высокогомологичных представителя (49 а.о.) [8, 15]. К сегодняшнему дню токсины морских анемон, в силу высокой токсичности, специфического действия на различные типы потенциал-зависимых натриевых каналов (Na_Vs), продолжают оставаться излюбленными объектами для токсикологов, молекулярных биологов, фармакологов и специалистов, занимающихся вопросами теоретической медицины (биомедицины).

Продолжающиеся поиск и исследование пептидов морской анемоны H. crispa преподнесли еще сюрприз: открытие одного необычного нейротоксина, названного нами RTX-VI, и второго – δ-SHTX-Hcr1f (идентичного Rp-II, согласно подобию аминокислотной последовательности с таковой нейротоксина Rp-II из R. paumotensis [9]). Оказалось, что у RTX-VI отсутствует функционально значимый для нейротоксинов типа 2 и типа 1 остаток Lys13/14 [15] (потерянный, очевидно, в ходе посттрансляционной модификации), а его аминокислотная последовательность аналогична таковой RTX-III [4] (за исключением отсутствующего остатка Lys13). Молекула RTX-VI состоит, таким образом, из двух цепочек, соединенных дисульфидными мостиками С1-С5 и С2-С4 (рис. 2). Согласно расчетным данным, нейротоксин RTX-VI сохранил фолд, характерный для анемонотоксинов обоих типов. Однако потеря Lys13 привела к утрате токсичности [15].

 

Рис. 2. Множественное выравнивание высокогомологичных аминокислотных последовательностей Heteractis нейротоксинов RTX-VI, RTX-III и δ-SHTX-Hcr1f (=Rp-II). На сером фоне показаны идентичные остатки в последовательностях, на белом фоне – точечные замены остатков, красным цветом – функционально значимый для связывания с Na_V остаток Arg13 [8]. Прямые линии в верхней части рисунка показывают соединение дисульфидных связей С1-С5 (а.о. 3-43), С2-С4 (а.о. 5-33), С3-С6 (а.о. 26-44) между остатками цистеина (показаны жирным шрифтом). Элайнмент выполнен с помощью программы Vector NTI

 

Интересно, что, несмотря на продолжающийся поиск новых представителей нейротоксинов среди новых видов морских анемон, до сих пор очень редко удается найти структуру, принадлежащую какому-либо новому NaTx [8].

1.2. Вторичная и пространственная структура Heteractis нейротоксинов

Высокое подобие аминокислотных последовательностей, идентичная локализация дисульфидных S–S связей и наличие консервативных остатков у нейротоксинов типа 1 и типа 2 (рис. 1, а, б; 2) позволили сделать заключение об их общем анцестральном гене [8]. Хотя до сих пор отсутствуют данные о 3D-структурах, установленных экспериментально, высокая гомология аминокислотных последовательностей нейротоксинов морских анемон обеспечивает наличие у всех представителей характерного дефензин-подобного фолда с близкой вторичной структурой (рис. 3) [15]. Согласно in silico расчетным данным вторичная структура нейротоксинов состоит из четырех β-тяжей и трех петель, одна из которых, так называемая Arg14 loop (для нейротоксинов типа 1), как было показано позже, обеспечивает аффинность их связывания с сайтом 3 Na_Vs и селективность по отношению к различным подтипам каналов [8].

Показано, что дипольные моменты молекул нейротоксинов типа 1 и типа 2 различаются как по величине, так и по направлению (рис. 3). Вероятно, этим объясняются различия в активности нейротоксинов и их возможности взаимодействовать с разными подтипами Na_Vs каналов. Различия между молекулярными поверхностями нейротоксинов обусловлены наличием отличающихся функционально значимых аминокислотных остатков, которые обеспечивают сохранение активности нейротоксинов по отношению к разным подтипам каналов.

 

Рис. 3. Ленточные диаграммы моделей 3D-структур нейротоксинов типа 1 и типа 2: АрА (тип 1), Sh-1 и RTX-III (тип 2), имеющих β-дефензин-подобный фолд (созданы на основе гомологичного моделирования 3D-структуры нейротоксина Sh-1). Стрелками показаны дипольные моменты; их величины обозначены в Дебаях (D): 183, 133, 109 [8, 15]

 

1.3. Изучение молекулярных механизмов взаимодействия с Na_Vs методами электрофизиологического тестирования и молекулярного моделирования

В настоящее время внимание исследователей акцентировано на всестороннем и детальном изучении молекулярных механизмов взаимодействия нейротоксинов с различными подтипами Na_Vs, участвующими в физиологических и патологических процессах, главным образом на их электрофизиологическом тестировании и определении cпецифичности модулирующего действия по отношению к различным подтипам. Так, совместно с бельгийскими и московскими коллегами было показано, что Heteractis нейротоксины RTX-III, RTX-VI и Rp-II, в отличие от нейротоксинов типа 1, например ATX-II, связываются с разными подтипами Na_Vs [15] (см. таблицу).

 

Действие нейротоксинов Rp-II (=δ-SHTX-Hcr1f), RTX-III, RTX-VI и ATX-II (10 мкМ) на токи каналов млекопитающих (Na_V1.1‒Na_V1.8), насекомых (BgNa_V1) и арахнид (VdNa_V1), экспрессированные в яйцеклетках Xenopus laevis [15]

NaTx	NaV1.1	NaV1.2	NaV1.3	NaV1.4	NaV1.5	NaV1.6	NaV1.7	NaV1.8	BgNaV1	VdNaV1
Rp-II	+	+	–	–	–	+	н.о.	–	+	+
RTX-III	–	–	+	–	–	+	н.о.	–	+	+
RTX-VI	–	+	–	–	-	+	н.о.	–	+	+
ATX-II	+	+	+	+	+	+	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.

Примечание. н.о. – активность нейротоксинов в отношении данных подтипов NaV не определяли

 

Записи токов через клеточную мембрану ооцита X. laevis, вызванные изменением мембранного потенциала в контрольных условиях и в присутствии 10 мкМ токсина (рис. 4), продемонстрировали эффективность взаимодействия RTX-III с подтипом Na_V1.3, а RTX-VI – с подтипом Na_V1.2. При этом оба нейротоксина связываются также с Na_V1.6 и подтипами членистоногих BgNa_V1 и арахнид VdNa_V1 (см. таблицу), что свидетельствует о перспективности их использования в качестве инсектотоксинов.

 

Рис. 4. Влияние δ-SHTX-Hcr1f (=Rp-II), RTX-III и RTX-VI на токи Na_Vs млекопитающих и паукообразных. Показаны записи токов через клеточную мембрану ооцита X. laevis, вызванных изменением мембранного потенциала, в контрольных условиях и в присутствии 10 мкМ токсина [15] (шкалы изменения амплитуд токов через каналы соответствуют 0,5–1 мкА за 5 мc)

 

Для понимания движущих сил взаимодействия нейротоксина δ-SHTX-Hcr1f с каналом rNa_V1.2 впервые было проведено полноатомное молекулярно-динамическое моделирование (МД симуляция) комплекса δ-SHTX-Hcr1f–rNa_Vs1.2, внедренного в липидный бислой (рис. 5), результаты которого свидетельствуют о существенных конформационных изменениях структуры канала при взаимодействии с токсином. Согласно расчетным данным заряженные С-концевые остатки (Lys48, Lys46, Glu31) координируют ориентацию токсина во внеклеточной области порового домена канала посредством сети электростатических взаимодействий и водородных связей. В то же время остатки Lys32, Asn25, Arg13 и Cys33 взаимодействуют с остатками Glu1616 (на S3 спирали) и Ser1621 (на S4 спирали) VSD-IV домена канала. При этом Cys33 образует две водородные связи с Val1620 и Ser1621 у основания спирали S4 VSD-IV [15].

 

Рис. 5. Взаимодействие δ-SHTX-Hcr1f (=Rp-II) c rNaV1.2: ленточная диаграмма комплекса δ-SHTX-Hcr1f–rNaV1.2 в ДПФХ липидном бислое; молекулярные поверхности δ-SHTX-Hcr1f окрашены в желтый, rNaV1.2 – в бордово-коричневый, ДПФХ – в голубой цвет (а); межмолекулярные взаимодействия в комплексе δ-SHTX-Hcr1f–rNaV1.2 – желто-зеленоватый цвет, показаны участвующие в связывании боковых цепей нейротоксина и канала водородные связи (зеленый пунктир), ионные и π-катионные взаимодействия (синие и оранжевые контуры соответственно) (б) [15]

 

Ранее в ходе электрофизиологических исследований было установлено, что благодаря наличию у токсина RTX-III гидрофобной поверхности его связывание с наружной поверхностью порового домена сайта-3 канала rNa_Vs1.2 стабилизирует образующийся белок-белковый комплекс (за счет образования межмолекулярных гидрофобных контактов [15]). Установлено, что вследствие ингибирования процесса инактивации канала замедляется фаза реполяризации потенциала действия мышечных и нервных волокон [8, 16, 17]. Таким образом, благодаря положительному инотропному эффекту нейротоксины способны оказывать кардиостимулирующий эффект, что может быть использовано в медицинской практике в ряде экстремальных ситуаций. Существенным препятствием для применения нейротоксинов морских анемон является их высокая токсичность для млекопитающих [8]. Тем не менее получение мутантных аналогов, подобных RTX-IV и RTX-V, низкотоксичных для млекопитающих [8], а также нетоксичного рекомбинантного rRTX-VI позволит преодолеть это затруднение.

2. α-Пороформирующие токсины (актинопорины). Структура и механизм взаимодействия с цитоплазматическими и модельными мембранами

Первые представители α-пороформирующих токсинов морских анемон (называвшихся первоначально гемолизинами и/или цитолизинами в силу способности формировать в цитоплазматических мембранах эукариотических клеток водопроницаемые поры, завершающиеся лизисом мембран и гибелью клеток) были выделены из водных гомогенатов животных в начале 70-х годов прошлого столетия [18–20]. Различными хроматографическими методами из R. macrodactylus (H. crispa) выделено в высокоочищенном состоянии четыре Radianthus (Heteractis) актинопорина, RTX-A, RTX-S, RTX-SII, RTX-G [21], а из Oulactis orientalis – два актинопорина, Or-A и Or-G [22]. На основании установленных нуклеотидных последовательностей кодирующих генов выведены полные аминокислотные последовательности полипептидов RTX-SII [23, 24], RTX-А [25], Or-A и Or-G [26] (рис. 6). Позже было показано, что Heteractis актинопорины принадлежат к мультигенному семейству [27].

 

Рис. 6. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей Radianthus и Oulactis актинопоринов. Выделены N-концевой фрагмент и POC-сайт связывания с мембраной, подчеркнут RGD/GGD-трипептид

 

К настоящему времени молекулярный механизм цитолитического действия актинопоринов достаточно хорошо исследован [28–35]. Он включает три стадии: 1) специфическое взаимодействие так называемого POC-сайта связывания актинопорина с фосфохолиновой головкой мембранного сфингомиелина (СМ) и последующее «заякоривание» молекулы в мембране (рис. 7, стадия 1) [30]; 2) конформационная перестройка N-концевого фрагмента молекулы (1–28 a.о.), который диссоциирует с поверхности белковой глобулы и погружается в липидный матрикс, при этом спирализованный участок N-конца (15–25 а.о.) удлиняется (рис. 7, стадия 2 ), и затем весь фрагмент включается в мембрану [31]; 3) ассоциация нескольких N-концевых фрагментов (четырех [18, 19, 28, 29] или восьми-девяти [32]), приводящая к образованию функциональной поры [33] (рис. 7, стадия 3).

 

Рис. 7. Трехступенчатый механизм порообразования (стадии 1–3). Ленточная диаграмма пространственной структуры актинопорина с функционально значимыми фрагментами (N-конец, POC-сайт) (а), связывание с мембранным сфингомиелином (СМ) и заякоривание в мембране N-конца (б), cхематичное изображение тороидальной поры (в) [33]

 

Изучение механизма взаимодействия Radianthus (Heteractis) актинопоринов с биологическими мембранами проводили на эритроцитах кролика [28, 29], яйцеклетках морского ежа Strongylocentrotus intermedius, в мембранах которых отсутствует СМ [34], и на культурах некоторых опухолевых клеток [35, 36]. В качестве модельных систем использовали липосомы [18, 19, 28] и бислойные липидные мембраны (БЛМ) [19, 20, 34] различного липидного состава. Установлено, что при отсутствии СМ в мембранах они остаются нечувствительными к действию актинопоринов [28, 29]. Показано, что образуемые актинопоринами поры/каналы являются катионселективными [29, 34, 37], при этом величина их гемолитической активности зависит от гидрофобности и направления гидрофобного момента молекулы [24, 33, 38], наличия и количества заряженных а.о. в N-концевом фрагменте, а также локализации а.о. Trp и Tyr ароматического POC-сайта связывания, количества образуемых гидрофобных, водородных и π-катионных взаимодействий с фосфохолиновой головкой СМ [38].

Нами была высказана гипотеза, что помимо POC-сайта связывания и амфифильного N-концевого фрагмента, участвующих в трехстадийном механизме взаимодействия с липидной мембраной (рис. 7) [33], актинопорины (например, RTX-Ala) имеют дополнительный (или альтернативный) сайт связывания – трипептид 141RGD143 (так называемый RGD-мотив, характерный для мембраноактивных пептидов и белков) [39]. Как известно, этот трипептид отвечает за адгезию клеток к внеклеточному матриксу и представляет собой минимальный интегринсвязывающий мотив RGD-распознающих интегринов. Cправедливость данной гипотезы подтверждает сравнительный анализ калориметрических кривых плавления нативных теней и модифицированных актинопорином, который показал наличие у последних сдвигов А-, B-, C- и D-переходов, характерных для белков цитоскелета эритроцита (рис. 8, а, б), а также вымывание из мембраны актина (рис. 8, в), что указывает на разрыв связи между актином цитоскелета и мембранными рецепторами, интегринами [40].

 

Рис. 8. Схема фрагмента эритроцитарной мембраны, мембранных белков и белков цитоскелета (а), калориметрические кривые (б), денситограммы SDS-электрофореза теней эритроцитов человека (интактные и модифицированные актинопорином RTX-А) (в) [40]

 

Очевидно, что такое взаимодействие RGD-мотива с интегрином αVβ3 объясняет способность актинопоринов ингибировать/блокировать процессы оплодотворения яйцеклеток спермой у морского ежа S. intermedius (поверхность головки сперматозоидов содержит трипептид RGD) (рис. 9, а, б) [39]. Согласно литературным данным, механизм оплодотворения яйцеклеток обусловлен связыванием трипептида RGD сперматозоидов с β-цепью мембранных интегринов яйцеклеток, αVβ3 и/или αVβ5 (рис. 9, а) [39], вызывающим разрыв связи интегрина с мембранным актином. Обнаруженный ранее разрыв связи между эритроцитарными интегринами и актином (рис. 8, в), основным белком цитоскелета, происходит под действием RGD-мотива актинопорина, а вымывание актина из мембраны ооцита, аналогичное происходящему в эритроцитах (рис. 8, в), ингибирует процесс оплодотворения яйцеклеток сперматозоидами (рис. 9, б).

 

Рис. 9. Оплодотворение яйцеклетки морского ежа S. intermedius спермиями (а), ингибирование оплодотворения яйцеклетки актинопорином RTX-Ala (б)

 

Установлено, что Radianthus (Heteractis) актинопорины, RTX-Ala, rHct-S3, обладают канцерпревентивным (противоопухолевым) действием, обусловленным нарушением путей сигнальной трансдукции [24, 35]. Они индуцируют р53-независимый апоптоз и ингибируют активность онкогенных AP-1 и NF-kВ ядерных факторов в концентрации 0,0338 нМ, которая более чем в 16 раз, меньше токсической концентрации RTX-Ala (0,57 нМ), проявляемой по отношению к опухолевым клеткам HeLa, THP-1, MDA-MB-231 и SNU-C4 [35, 36]. Очевидно, противоопухолевую активность актинопоринов можно объяснить как цитолитическим действием невысоких концентраций этих полипептидов на цитоплазматические мембраны опухолевых клеток, так и взаимодействием их RGD-мотива с мембранными интегринами этих клеток, приводящим к блокированию их пролиферации [35]. Таким образом, очевидно, что характерный для всех представителей a-пороформирующих токсинов морских анемон RGD-мотив способен проявлять себя дополнительным сайтом связывания этих токсинов с биологическими и модельными мембранами. Cпособность нетоксичных концентраций актинопоринов подавлять рост опухолевых клеток и предотвращать развитие некоторых видов рака позволяет рассматривать актинопорины в качестве возможной модели для конструирования на их основе препаратов, тормозящих и предотвращающих развитие злокачественных опухолей.

3. Нетоксичные пептиды морской анемоны H. crispa (=Н. magnifica)

3.1. Пептиды Кунитц-типа: структура и активность

Первая структура ингибитора сериновых протеаз трипсина и химотрипсина (пептида Кунитц-типа) InIV была установлена в 1984 г. методом автоматической деградации по Эдману [41]. Тогда же впервые было обнаружено наличие еще не менее 12 представителей пептидов Кунитца в исследуемом образце R. macrodactylus. В дальнейшем их выделение и изучение было продолжено только через 20 с лишним лет методами белковой химии и молекулярной биологии. Так, впервые было установлено, что пептиды Кунитц-типа кодируются разными мультигенными семействами и образуют комбинаторную библиотеку, включающую, согласно структурно-функциональному и филогенетическому анализу (рис. 10, а,б), пептидные кластеры, состоящие из 33 HCGS-, 33 HCRG- и 6 HCTX-пептидов, близких по структуре, но отличающихся физико-химическими характеристиками и функциональной активностью [42, 43]. Установлено, что основные отличия аминокислотных последовательностей Кунитц-пептидов (в виде точечных замен остатков) находятся в реактивном сайте, а также в сайте слабых взаимодействий (рис. 10, а), а функционально значимые остатки, аргинин, лизин, треонин (14K/R/T), определяющие эволюционную функционализацию и кластеризацию пептидов, – в Р1 положении последовательности (рис. 10, б) [42].

 

Рис. 10. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей пептидов Кунитца морской анемоны H. crispa: APHC1, APHC2, APHC3, InhVJ, HCRG1, HCRG2, HCRG21, HCGS 1.10, HCGS 1.19, HCGS 1.20, HCGS 1.36, HCTX1, токсинов анемоны Stichodactyla mertensii SMTX1 и SMTX A49E, Stichodactylа helianthus SHTXIII, а также ингибитора трипсина BPTI из B. taurus; идентичные а.о. показаны на темно-сером фоне, консервативные – на светло-сером (а). Филогенетическое дерево пептидов Кунитц-типа из морских анемон семейств Actiniidae и Stichodactylidae, построенное методом минимальной эволюции; представители комбинаторной библиотеки H. crispa формируют на дереве четыре кластера: I–III представлены HCGS-/HCRG-пептидами, IV – HCTX-пептидами; HCGS-пептиды обозначены красными кружками, HCRG-пептиды – зелеными, HCTX/SMTX-пептиды – голубыми; последовательности пептидов с P1Lys показаны на синем фоне, с P1Thr – на розовом фоне, с P1Arg – на зеленом фоне [42] (б)

 

Появление положительно заряженного P1Lys и полярного P1Thr в реактивном сайте способствовало, соответственно, субфункционализации и неофункционализации пептидов Кунитц-типа, а действие ускоренной эволюции на их гены в рамках отдельного вида H. crispa/Н.magnifica привело к появлению комбинаторных библиотек [42, 43].

Исследование взаимодействия нативных и рекомбинантных пептидов Кунитц-типа H. crispa с молекулярными мишенями продемонстрировало, что они ингибируют трипсин и химотрипсин [44–46], а некоторые из них (HCRG1 и HCRG2 с P1Lys) являются не только ингибиторами протеаз, но и модуляторами потенциал-зависимых калиевых каналов (K_v1.1, K_v1.2, K_v1.3, K_v1.6, Shaker IR) [47], т.е. представляют собой бифункциональные пептиды Кунитц-типа.

Впервые обнаружено, что нативные пептиды APHC1–APHC3 и рекомбинантный пептид rHCRG21, имеющие треонин в P1 положении аминокислотной последовательности, модулируют TRPV1-рецептор [48, 49], причем rHCRG21 является его полным антагонистом (рис. 11) [49]. В концентрации 100 мкМ он блокирует индуцированные капсаицином токи в канале на 95%. Полумаксимальное ингибирование рецептора наблюдается при концентрации rHCRG21 6,9 мкM, благодаря чему пептид проявляет анальгетическую активность in vivo в модели тепловой стимуляции боли [49, 50] (в настоящее время rHCRG21 находится на стадии доклинических испытаний).

 

Рис. 11. Электрофизиологический анализ ингибирующего действия пептида rHCRG21 на TRPV1. Оценка активности TRPV1 в контрольных условиях и в присутствии rHCRG21 (10 мкM) (а); оценка проводимости TRPV1 при коаппликации капсаицина (CAP) (2 мкM) с rHCRG21 (10 мкM) (б) (капсазепин (CZP) (10 мкM) использован в качестве стандартного антагониста (n ≥ 3)) [49]

 

Установлено, что пептиды HCRG1 и HCRG2 подавляют синтез провоспалительных медиаторов (proIL-1β, IL-6 и TNFα), индуцированный добавлением бактериального ЛПС [46]. Согласно результатам in vivo испытаний и in vitro тестирования на различных клеточных культурах, установлено, что рекомбинантные пептиды rHCGS1.10, rHCGS1.19, rHCGS1.20 и rHCGS1.36 обладают противовоспалительной активностью [51]. В концентрациях 1–10 мкМ пептиды rHCGS1.19, rHCGS1.20, rHCGS1.36, rHCTX1 и rSMTX1 A49E проявляют антигистаминную активность, обусловленную, по-видимому, либо блокированием Н1-гистаминовых рецепторов, либо взаимодействием с G-белками [52]. Возможно также, что они оказывают ингибирующее действие на потенциал-зависимые кальциевые (Ca_vs) каналы эндоплазматического ретикулума [52], а в концентрациях 0,01–10 мкМ влияют на развитие окислительного стресса в макрофагах, стимулированных ЛПС (уменьшают образование АФК и NO, вероятно, за счет ингибирования активности iNOS или протеиназ, вовлеченных в воспалительный процесс) [46, 52].

Высказано предположение, что пептиды Кунитц-типа эволюционировали от ингибиторов Кунитца, главная функция которых – ингибирование сериновых протеаз. Несмотря на сохранение фолда общего предка (рис. 10, б), пептиды Кунитц-типа, находясь под сильным давлением дарвиновского положительного отбора и благодаря многочисленным мутационным процессам в функционально и эволюционно независимых сайтах, происходящих в ходе диверсификации, приобрели еще одну функциональную активность – способность ингибировать различные типы ионных каналов [42]. Это расширение биологических мишеней ряда представителей пептидов Кунитца обусловило проявление ими полифункциональности по отношению к протеазам, ионным каналам и ионотропным рецепторам [41–51].

Протеомный анализ ядовитого секрета H. magnifica, проведенный методами хроматографии и масс-спектрометрии, позволил обнаружить в токсической фракции и идентифицировать 326 пептидов, относящихся к нейротоксинам различных семейств, ингибиторам протеаз Кунитц-типа, дефензин-подобным ингибиторам α-амилаз [53]. Так, недавно из H. magnifica [54] выделен в индивидуальном состоянии новый нетоксичный пептид, магнификамид (4,7 кДа, 44 а.о.), обладающий высокой степенью гомологии с известным β-дефензином из S. helianthus, хелиантамидом [55] (рис. 12), который является ингибитором панкреатической α-амилазы, участвующей в развитии диабета второго типа. Наличие высокой ингибиторной активности по отношению к различным α-амилазам свидетельствует о возможном фармакологическом потенциале магнификамида [54].

 

Рис. 12. Аминокислотные последовательности дефензинов морских анемон Н. magnifica [54] и S. helianthus [55]. Идентичные а.о. показаны на светло-сером фоне, точечные замены остатков – на белом фоне, остатки цистеина выделены жирным шрифтом. Звездочками отмечен реактивный сайт взаимодействия с α-амилазам

 

3.2. APETx-подобные пептиды: структура, функциональная активность

Протеомные исследования морской анемоны H. crispa (=H. macrodactylus) [54, 56], проведенные в лаборатории, выявили в ее транскриптах пептиды, молекулярная масса которых равна 4,5 кДа, кроме того, аминокислотные последовательности (41–42 а.о. (рис. 13) [56]) казались гомологичны таковым токсинов APETx1 и APETx2 морской анемоны Anthopleura elegantissima [57, 58]. Как известно, APETx2 является модулятором кислоточувствительных ионных каналов (ASICs – Acid-sensing ion channels) и оказывает на них ингибирующий эффект [58].

 

Рис. 13. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей APETx-подобных пептидов из H. crispa: Hcr 1b-1 (P0DL87), Hcr 1b-2 (C0HL52), Hcr 1b-3 (C0HL53), Hcr 1b-4 (C0HL54) [56], APETx1 (P61541) и APETx2 (P61542) из A. elegantissima [57]. Идентичные остатки изображены на светло-сером фоне, точечные замены остатков – на белом фоне. Элайнмент выполнен с помощью программы Vector NTI [56]

 

Известно, что ASICs участвуют в восприятии кислотоопосредованной, воспалительной и постоперационной боли, обусловленных патологическими процессами [57, 58]. Электрофизиологическое исследование пептидов Hcr 1b-1–Hcr 1b-4 на ASICs каналах показало наличие ингибирующего (для всех пептидов) и/или потенцирующего (для Hcr 1b-4) эффектов, поэтому их отнесли к группе APETx-подобных пептидов, которые, в отличие от токсинов APETx1 и APETx2, нетоксичны in vivo даже в высоких концентрациях [59].

Впервые для представителей Hcr 1b-2–Hcr 1b-4 морских анемон обнаружено ингибирующее действие на токи подтипа ASIC1a [59] (который участвует в процессах передачи нервного возбуждения, гибели нейронов, эпилепсии, ишемических процессах [58]). Показано, что в насыщающих концентрациях (100–120 мкМ) Hcr 1b-2–Hcr 1b-4 ингибируют амплитуду тока через ASIC1a каналы на 64, 70 и 86%, а пептиды Hcr 1b-2 и Hcr 1b-3 (120 мкМ) ингибируют токи ASIC3 подтипа на ~81% и ~74% соответственно [59].

Интересной особенностью нетоксичных APETx-подобных пептидов H. crispa, отличающей их от токсичного APETx2, имеющего остаток R17, важный для сохранения его ингибирующей активности, является замена этого положительно заряженного остатка на гидрофобный Leu17. Очевидно, эта мутация объясняет отсутствие у пептидов токсической активности и, вероятно, имеет важное значение при проведении фармакологических исследований. Согласно данным молекулярного моделирования и пространственным моделям пептидов, различия в величинах ингибирующей активности пептидов по отношению к разным подтипам ASICs (рис. 14, а, б) могут быть связаны с различным направлением и величиной их дипольных моментов, играющих важную роль во взаимодействиях с мишенями [56, 59].

 

Рис. 14. Модель 3D структуры комплекса Hcr 1b-1–ASIC (а). Ленточные диаграммы моделей 3D структур молекул APETx2, Hcr 1b-2, Hcr 1b-3 и Hcr 1b-4 (б) [56, 59]. Дипольные моменты молекул показаны стрелками, эквипотенциальные поверхности (молекулярные электростатические потенциалы – МЭП) окрашены в розовый цвет (отрицательный потенциал) и синий (положительный), выполнены с помощью программ SPDBV и Chimera

 

Неожиданным оказалось обнаружение потенцирующего действия пептида Hmg 1b-4 при его аппликации к ASIC3 подтипу, благодаря чему он, не вызывая активацию канала, увеличивает амплитуду протон-индуцированных токов до 208% [59]. Показано, что APETx-подобные пептиды H. crispa оказывают выраженный обезболивающий эффект на модели кислотоиндуцированной мышечной боли, ассоциированной с функцией ASICs каналов. При этом их действующие концентрации значительно ниже, чем у анальгина [59]). В то же время анальгетическая активность пептидов была аналогична и сравнима с активностью диклофенака. При остром местном воспалении, вызванном гамма-каррагинаном или полным адъювантом Фрейнда, Hmg 1b-4 показал более выраженный и статистически значимый противовоспалительный эффект, чем Hmg 1b-2. В связи с этим APETx-подобные пептиды H. crispa можно рассматривать в качестве перспективных анальгетиков, действие которых направлено на коррекцию активности ASICs каналов.

Заключение

Токсичные и нетоксичные пептиды, нацеленные на Na_Vs, К_Vs, ASICs каналы, TRP-рецепторы, компоненты цитоплазматических мембран и цитоскелета, являются молекулярными инструментами для манипуляций с этими биологическими мишенями in vitro и in vivo. Они представляют собой многообещающие лиганды для создания на их основе мутантных и рекомбинантных аналогов с заданными характеристиками, активностью и фармакологическим потенциалом, которые смогут найти терапевтическое применение при лечении многих патофизиологических состояний. На это направлены исследования, успешно проводящиеся в настоящее время сотрудниками лаборатории молекулярной фармакологии и биомедицины ТИБОХ ДВО РАН, созданной на базе ЛХП несколько лет назад.

About the authors

Margarita M. Monastyrnaya

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS

Author for correspondence.
Email: rita1950@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3157-0930

Doctor of Chemical Sciences, Leading Researcher

Russian Federation, Vladivostok

Emma P. Kozlovskaya

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS

Email: kozempa@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8110-0382

Doctor of Chemical Sciences, Chief Researcher, Professor

Russian Federation, Vladivostok

References

Supplementary files