INDEL-типирование штаммов парагемолитических вибрионов in vitro и in silico

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

В статье представлены результаты изучения распределения INDEL-генотипов Vibrio рarahaemolyticus в мире и Российской Федерации in vitro и in silico с использованием ранее разработанного способа INDEL-типирования на основании распределения аллелей шести локусов (Vp967, Vp08, Vp619, Vp2256, VpA472 и Vp506). Среди 2105 штаммов V. parahaemolyticus, взятых в исследование, было выявлено 30 уникальных INDEL-генотипов, семь из которых определены как мажорные. При этом выявлена географическая привязанность генотипа парагемолитических вибрионов к месту их выделения. На территории Российской Федерации выявлена циркуляция 17 INDEL-генотипов, преобладающим из которых оказался D2, обнаруженный только в Российской Федерации. Установлено, что предложенный метод INDEL-типирования является полезным инструментом при проведении эпидемиологических расследований, дающим возможность выявлять филогенетические связи между различными изолятами, что в свою очередь позволяет делать выводы об источниках заносов возбудителя на конкретную территорию.

Полный текст

Введение

Парагемолитические вибрионы – условно-патогенные галофильные микроорганизмы семейства Vibrionaceae, обитающие в морской и эстуарной среде по всему миру [1]. Выделяются из морской воды, рыб, креветок, мидий, устриц, омаров, крабов. Способны вызывать пищевые гастроэнтериты, протекающие по типу пищевой токсикоинфекции. Основной способ передачи заключается в употреблении в пищу сырых или недостаточно термически обработанных морепродуктов [2]. В редких случаях Vibrio parahaemolyticus вызывает раневую инфекцию, ушную инфекцию или сепсис, которые могут быть опасными для жизни людей с сопутствующими заболеваниями [3].

Впервые V. parahaemolyticus идентифицирован как причина пищевой инфекции в Японии в 1950 г. [4]. С 1960–1970-х годов парагемолитические вибрионы были обнаружены в прибрежных зонах морей и океанов, а вызываемые ими заболевания начали регистрировать в странах Азии, Африки, Америки, Западной Европы и Австралии. Патогенность V. parahaemolyticus связывают с наличием генов гемолизинов – термостабильного прямого (TDH – thermostable direct hemolysin) и TDH-родственного (TDH – related hemolysin) [5]. Для штаммов парагемолитических вибрионов характерна высокая генетическая вариабельность. Появление в 1996 г. в Индии нового клона V. parahaemolyticus O3: K6 привело к первому документированному так называемому пандемическому распространению V. parahaemolyticus [6]. Характерной особенностью данных штаммов является повышенный эпидемический и патогенетический потенциал.

На территории России галофильные вибрионы широко распространены в водах Азовского, Черного, Каспийского, Балтийского и Японского морей. Крупные вспышки были отмечены на побережье Черного и Азовского морей в 1984–1986 гг., во Владивостоке – в 1997, 2001, 2002, 2007 гг., а также в пос. Славянка Хасанского района Приморского края в 2012 г. [7–9].

Расследование вспышек опасных инфекционных заболеваний требует разработки эффективных методик внутривидовой дифференциации возбудителей и поиска генетических маркеров групп штаммов, имеющих большое эпидемиологическое значение. Одним из перспективных способов генотипирования, позволяющих выявлять индивидуальные различия и филогенетические связи между штаммами, является метод INDEL-типирования, основанный на определении вставок-делеций (IN-sertion-DELetion) в различных генах [10–12]. Ранее нами был предложен метод INDEL-типирования V. parahaemolyticus на основании распределения аллелей шести локусов (Vp967, Vp08, Vp619, Vp2256, VpA472 и Vp506) и показана возможность его использования [13]. Метод удобен и, главное, позволяет уверенно проводить INDEL-типирование in silico на основании сиквенсов из международных баз данных. В связи с этим целью настоящей работы является изучение распределения INDEL-генотипов V. parahaemolyticus в мире и Российской Федерации in vitro и in silico.

Материалы и методы

В исследование in vitro было взято 122 штамма V. parahaemolyticus, выделенных из различных источников в регионах Черного, Азовского, Японского морей на территории Российской Федерации в период с 2008 по 2020 г. Культуры были получены из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, где хранились в лиофилизированном состоянии. ПЦР с сконструированными праймерами к шести INDEL-локусам вибрионов (табл. 1) проводили по ранее описанной методике [13, 14].

 

Таблица 1. INDEL-локусы и праймеры, использованные в работе

INDEL-локус

Размер ампликона, п. о.

Структура праймеров

прямой

обратный

Vp967

112/94

acaaaagagcgagcactgaaac

gatccaagatgagctggaaaac

Vp08

104/89

tgaaaaactgggttaaggttgc

agacatgcccaccttgacttc

Vp619

114/92

acctgtgactgaaccagaacc

cccactgaatgaagctacctgt

Vp2256

111/99

aaaaagcggcagataatgcac

ccttatcaatggcttcttgtcc

VpA472

95/77

cgtgaactggcaagactgga

ccaatgcgatttggtaagtgtc

Vp506

85/79

aagcaccacagtcatcctgtaa

gcggtctgtagtcgtgtgaa

 

Виртуально in silico было изучено 1983 штамма из базы данных GenBank с известным географическим происхождением. Для анализа применяли авторское программное обеспечение Gene Expert, PrimerM и VirtualPCR, написанное на языке программирования Java. Сведения о месте и времени выделения штаммов были взяты из описания в GenBank. Кластерный анализ и построение дендрограммы проводили с использованием авторского программного обеспечения по методу UPGMA. Для построения дендрограммы использовали программу MEGA 5 [15].

Результаты

Среди включенных в исследование 2105 штаммов V. parahaemolyticus было выявлено 30 уникальных INDEL-генотипов, которые распределились между 15 кластерами, обозначенными буквами латинского алфавита с А по О (см. рисунок).

 

Дендрограмма, построенная на основе кластерного анализа распределения аллелей INDEL-локусов у штаммов V. parahaemolyticus

 

Установлено существование семи мажорных генотипов, представленных более чем 100 изолятами (С2, Н2, L2, N1, N2, O1 и O2) и 23 минорных генотипа. В табл. 2 показано географическое распределение штаммов мажорных INDEL-генотипов в мире и Российской Федерации.

 

Таблица 2. Свойства мажорных INDEL-генотипов V. parahaemolyticus

INDEL-генотип

Число штаммов

Распространение в мире

(по анализу in silico), годы

Распространение в России

(по результатам in

vitro), годы

С2

252

Китай (121), 2008–2018; США (96), 2008– 2019; Перу (18), 2011–2016; Канада (7), 2008; Испания (6), 2012; Индия (1), 2014

Владивосток (3), 2019

H2

102

Китай (69), 2008–2017; США (21), 2008– 2017; Перу (5), 2015–2017; Малайзия (3), 2014; Южная Корея (2), 2014, 2015

Таганрог (1), 2015; Геленджик (1), 2020

L2

205

Китай (151), 2008–2018; США (45), 2012– 2014; Перу (2), 2009, 2017; Канада (2), 2008, 2010; Таиланд (2), 2008, 2015

Владивосток (1), 2019; Таганрог (Азовское море) (1), 2019; Новороссийск (1), 2015

N1

286

Китай (122), 2008–2019; США (94), 2009– 2018; Перу (18), 2015–2017; Канада (3), 2009, 2012–2013; Таиланд (2), 2014; Малайзия (24), 2014, 2016–2017; Чили (1), 2015; Германия (1), 2009; Вьетнам (1), 2014; Южная Корея (2), 2016, 2017; Индия (1), 2016, Мексика (2), 2019; Венесуэла (1), 2018

Приморский край (10), 2015– 2020; Азовское море (2), 2016, 2019; Черное море (2), 2012, 2020

N2

239

Китай (123), 2008–2019; США (72), 2008– 2019; Перу (12), 2015–2017; Канада (4), 2008–2010; Малайзия (2), 2009, 2017; Вьетнам (5), 2012–2014; Филиппины (1), 2015; Южная Корея (1), 2014; Мексика (1), 2014; Венесуэла (2), 2018; Испания (1), 2012; Великобритания (1), 2010

Приморский край (10), 2015– 2021; Азовское море (2), 2019; Черное море (2), 2020

O1

292

Китай (154), 2008–2019; США (79), 2008– 2019; Перу (18), 2013–2017; Канада (5), 2008, 2011–2012, 2014; Южная Корея (2), 2014; Мексика (8), 2013, 2014, 2019; Вьетнам (2), 2014; Индия (2), 2017; Венесуэла (2), 2018; Тихий океан (2), 2016

Азовское море (1), 2019; Черное море (2), 2020; Приморский край (15), 2009–2020

O2

304

Китай (126), 2008–2019; США (89), 2008– 2019; Перу (49), 2008–2011, 2014–2017; Канада (7), 2009–2015; Южная Корея (1), 2017; Малайзия (3), 2016; Англия (4), 2014, 2009, 2010; Мексика (2), 2013; Венесуэла (2), 2018; Чили (2), 2015

Азовское море (4), 2015–2019; Черное море (1), 2015; Приморский край (14), 2009–2020

 

При анализе in vitro INDEL-генотипов 122 штаммов, выделенных в Российской Федерации, показано наличие 17 генотипов (5 мажорных и 12 минорных). При этом 4 «мировых» мажорных генотипа (О1, О2, N1 и N2) составили более 50% (64 штамма). Однако преобладающими оказались штаммы INDEL-генотипа D2, который в мире больше нигде не встречался и был характерен только для Российской Федерации (табл. 3). При этом большинство штаммов (31) данного генотипа было выделено на территории Приморского края, из них 3 культуры от больного во Владивостоке в 2008 г. и 28 культур при вспышках в Уссурийске и пос. Славянка Хасанского района в 2012 г. И только 1 штамм INDEL-генотипа D2 был изолирован из морской воды в Таганроге в 2015 г.

 

Таблица 3. Мажорные INDEL-генотипы на территории Российской Федерации

Генотип

Число штаммов

Регион, год

D2

32

Славянка, 2012 (28); Владивосток, 2008 (3); Таганрог (1)

О1

18

Владивосток, 2018, 2019, 2020

О2

19

Владивосток, 2018, 2019, 2020

N1

13

Владивосток, 2021; Новороссийск, 2012

N2

14

Владивосток, 2018–2020

 

Обсуждение

При изучении вариабельности штаммов в соответствии с географической принадлежностью установлено, что мажорные генотипы (С2, Н2, L2, N1, N2, O1 и O2) укоренились в своих регионах (Китай и США). Это подтверждается сохранением и циркуляцией вибрионов данных INDEL-генотипов на одной территории в течение долгого времени, именно в указанных регионах выделяют преобладающее количество штаммов. Согласуется это и с литературными сведениями о том, что V. parahaemolyticus является ведущим патогеном пищевого происхождения в Китае [16] и основной причиной гастроэнтерита, вызываемого морепродуктами, в США [17]. Штаммы минорных INDEL-генотипов, как правило, были выделены из объектов окружающей среды.

Особый интерес представляет вопрос распространения патогенных микроорганизмов на другие территории. Обращает внимания факт выделения в Перу в 2009 и 2017 гг. штаммов INDEL-генотипов L2 и О2, регистрируемых до этого в Китае. Раннее исследователями [18] было показано, что вспышка, которая произошла в 2009 г. в городах Республики Перу, обусловлена изолятами V. parahaemolyticus, принадлежащими к одному клональному комплексу, прежде описанному исключительно в Азии. Это не первый случай интродукции азиатских популяций патогенного V. parahaemolyticus на Тихоокеанское побережье Южной Америки. Как предполагается, такое может быть опосредовано действием Эль-Ниньо, за счет которого область нагретых приповерхностных вод смещается к востоку [18].

Штаммы, выделенные в 2012 г. в Испании и США, отнесены к одним и тем же INDEL-генотипам C2 и N2. Генетическое сходство этих штаммов подтверждается литературными данными о том, что летом 2012 г. вспышки инфекции V. parahaemolyticus, вызванные одинаковыми серотипами, произошли на Атлантическом побережье США и Испании и были связаны с потреблением морепродуктов. На общность данных «вспышечных» штаммов, полученных от пациентов из США и Испании, указывали результаты серологических тестов, ПЦР анализа на факторы вирулентности, гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE) и метода типирования MLST. Вероятно, возможными механизмами распространения в окружающей среде и интродукции штаммов V. parahaemolyticus являются импорт и хранение живых зараженных двустворчатых моллюсков в местных водах, перенос штаммов с балластными водами на большие расстояния по океану в новые регионы. И в Нью-Йорке, и в Галисии ранее были вспышки инфекции V. parahaemolyticus, вызванной другими штаммами, что, видимо, обусловлено близостью крупных портов. Вспышки как в США, так и в Испании соответствовали во времени и пространстве более высоким, чем обычно, температурам поверхностной морской воды, что способствует увеличению распространения парагемолитических вибрионов [19].

Регистрация генотипов штаммов V. parahaemolyticus, не типичных для территорий, в отдельные годы отмечена также в Канаде, Испании, Индии и ряде других стран (табл. 2), что, вероятно, связано с заносом возбудителя на эти территории.

Стоит отметить, что штаммы, выделенные в Германии, представлены только двумя изолятами, отнесенными к генотипу N1 и L1. Штамм INDEL-генотипа N1 выделен в Германии из вод залива Балтийского моря (Килер-Фёрде) в 2009 г., а L1 – из вод Северного моря (порт Дагебюлль) в 2011 г. Отсутствие укоренения штаммов в акваториях Германии, вероятно, связано с температурой воды, которая значительно ниже по сравнению с тропическими морями. Распространение парагемолитических вибрионов в морской среде напрямую связано с температурой воды, и данный микроорганизм редко выявляется при температуре ниже 15 °, однако из-за глобального потепления на побережье Балтийского моря летом может возрасти количество инфекций, вызванных появлением в воде вибрионов [20].

Встречаемость «мировых» мажорных генотипов у штаммов, выделенных в Российской Федерации, говорит о периодических заносах этих штаммов на территорию нашей страны. Так, штаммы генотипа С2, общее количество которых составило 252 и которые в течение нескольких лет выделялись на территории США (2008–2019 гг.), Китая (2008–2018 гг.) и Перу (2011–2016 гг.), в России были обнаружены только в 2019 г. на территории Приморского края (г. Владивосток). Изоляты генотипа H2, циркулирующие в США (2008–2017 гг.), Китае (2008– 2017 гг.), Перу (2015–2017 гг.), были выделены в Таганроге в 2015 г. и Геленджике в 2020 г. Парагемолитические вибрионы генотипа L2, укоренившиеся в Китае, США и Перу, также были изолированы в Владивостоке и Таганроге только в 2019 г. и Новороссийске в 2015 г. Штаммы INDEL-генотипов N1, N2, O1, O2 оказались преобладающими среди выделенных в Российской Федерации и циркулировали в отдельных регионах в течение нескольких лет.

В результате оценки INDEL-профилей, полученных при типировании in vitro коллекционных штаммов парагемолитических вибрионов, изолированных в Российской Федерации, выявлен генотип D2, который был представлен большинством изолятов и характерен только для Приморского края Российской Федерации. Штамм данного генотипа, выделенный из воды Азовского моря у г. Таганрог, можно считать завозным.

Заключение

В ходе проведенной работы показано, что предлагаемый метод INDEL-типирования V. parahaemolyticus на основании распределения аллелей 6 локусов является полезным инструментом для изучения молекулярной эпидемиологии, позволяющим выявлять особенности территориального распределения различных генотипов штаммов, и может быть успешно использован в эпидемиологическом надзоре при расследовании вспышек заболеваний. Указанный способ INDEL-типирования эффективен при анализе результатов полногеномного секвенирования вибрионов из международных баз данных в формате in silico, а также для типирования in vitro штаммов V. parahaemolyticus, выделенных в различных регионах Российской Федерации. Было выявлено 30 уникальных INDEL-генотипов, которые на основе кластерного анализа распределились между 15 кластерами. При этом установлено существование 7 «мировых» мажорных генотипов. Среди 17 INDEL-генотипов штаммов, выделенных на территории Российской Федерации, преобладающим оказался D2, который в мире нигде больше обнаружен не был. Полученные результаты изучения генотипов штаммов V. parahaemolyticus позволяют говорить об их географической привязанности к определенной территории, а встречаемость штаммов парагемолитических вибрионов различных INDEL-генотипов в разных регионах связано с их широким распространением с балластными водами судов и по путям транспорта морепродуктов, что согласуется с литературными данными [21, 22]. Также одной из движущих сил распространения вибрионов, по-видимому, являются океанские течения.

×

Об авторах

Ольга Сергеевна Чемисова

Донской государственный технический университет

Email: chemisova@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-4059-2878

кандидат биологических наук, доцент

Россия, Ростов-на-Дону

Оксана Алексеевна Цырулина

ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора

Email: rykowskaya.oxana@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6176-2605

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Россия, Ростов-на-Дону

Алексей Сергеевич Водопьянов

ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора

Email: alexvod@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9056-3231

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник

Россия, Ростов-на-Дону

Сергей Олегович Водопьянов

ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора

Email: serge100v@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4336-0439

доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник

Россия, Ростов-на-Дону

Маргарита Мардиросовна Сагакянц

ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: margsagak@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-8235-3288

научный сотрудник

Россия, Ростов-на-Дону

Список литературы

  1. Wang R. Z., Huang J. D., Zhang W. et al. Detection and identification of Vibrio parahaemolyticus by multiplex PCR and DNA-DNA hybridization on a microarray // J. Genet. Genomics. 2011. Vol. 38. P. 129–135. doi: 10.1016/j.jgg.2011.02.002.
  2. Broberg C. A., Calder T. J., Orth K. Vibrio parahaemolyticus cell biology and pathogenicity determinants // Microbes Infect. 2011. Vol. 13. P. 992–1001. doi: 10.1016/j.micinf.2011.06.013.
  3. Zhang L., Orth K. Virulence determinants for Vibrio parahaemolyticus infection // Curr. Opin. Microbiol. 2013. Vol. 16 (1). P. 70–77. doi: 10.1016/j.mib.2013.02.002.
  4. Nair G. B., Ramamurthy T., Bhattacharya S. K. et al. Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3: K6 and its serovariants // Сlin. Microbiol. Rev. 2007. Vol. 20, N1. P. 39–48. doi: 10.1128/CMR.00025–06.
  5. Yeung P. S., Boor K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections // Foodborne Pathog. Dis. 2004. Vol. 1. P. 74–88. doi: 10.1089/153531404323143594.
  6. Velazquez-Roman J., Leоn-Sicairos N., Hernаndez-Diaz L., Canizalez-Roman A. Pandemic Vibrio parahaemolyticus O3: K6 on the American continent // Front. Cell. Infect. Microbiol. 2013. Vol. 3. P. 110. doi: 10.3389/fcimb.2013.00110.
  7. Маслов Д. В. Вспышка галофилеза среди населения города Владивостока Приморского края // Здоровье населения и среда обитания. 1997. № 12 (57). С. 17–21.
  8. Ломов Ю. М., Кудрякова Т. А., Македонова Л. Д. и др. Галофильные вибрионы, обусловившие вспышку пищевой токсикоинфекции во Владивостоке // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001. № 6. С. 3–7.
  9. Рыковская О. А., Мазрухо А. Б., Смоликова Л. М., Монахова Е. В., Чемисова О. С., Подойницына О. А. и др. Vibrio parahaemolyticus серогруппы О3: К6 – возбудитель вспышек пищевой токсикоинфекции в Приморском крае Российской Федерации // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2013. № 4. С. 57–61.
  10. Водопьянов А. С., Водопьянов С. О., Олейников И. П., Мишанькин Б. Н. INDEL-типирование штаммов Vibrio cholerae // Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 2017. Т. 22 (4). С. 195–200. doi: 10.18821/1560-9529-2017-22-4-195-200.
  11. Liu F., Hu Y., Wang Q. et al. Comparative genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates // BMC Genomics. 2014. Vol. 15, N1. Р. 469. doi: 10.1186/1471-2164-15-469.
  12. Larsson P., Svensson K., Karlsson L. Canonical Insertion-Deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis // Emerg. Infect. Diseases. 2007. Vol. 13, N11. Р. 1725–1732. doi: 10.3201/eid1311.070603.
  13. Чемисова О. С., Водопьянов А. С. Рыковская О. А. и др. Молекулярное типирование штаммов Vibrio parahaemolyticus на основе INDEL-маркеров // Инфекцион. болезни. 2018. № 7 (3). С. 26–30. doi: 10.24411/2305-3496-2018-13004.
  14. Мишанькин Б. Н., Водопьянов А. С., ЛомовЮ.М. Мультилокусное VNTR-типирование культур холерных вибрионов, выделенных в г. Казань во время вспышки холеры летом 2001 года // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2003. № 6. С. 11–15.
  15. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods // Mol. Biol. Evol. 2011.Vol. 28. Р. 2731–2739.
  16. Xiao Chen, Qiaoyun Zhu, Fei Yu, Wen Zhang et al. Serology, virulence and molecular characteristics of Vibrio parahaemolyticus isolated from seafood in Zhejiang province // PLOS One. 2018. Vol. 13, N 10. e0204892. doi: 10.1371/journal.pone.0204892.
  17. Scallan E., Hoekstra R.M., Angulo F.J. et al. Foodborne Illness Acquired in the United States-Major Pathogens // Emerg. Infect. Diseas. 2011. Vol. 17. Р. 7–15. doi: 10.3201/eid1701.P11101.
  18. Martinez-Urtaza J., Huapaya B., Gavilan R.G. et al. Emergence of Asiatic Vibrio diseases in South America in phase with El Niño // Epidemiology. 2008. Vol. 19, N 6. Р. 829–837. doi: 10.1097/EDE.0b013e3181883d43.
  19. Martinez-Urtaza J., Baker-Austin C., Jones J.L. et al. Spread of Pacific Northwest Vibrio parahaemolyticus // N. Engl. J. Med. 2013. Vol. 369. Р. 1573–1574. DOI: 10.1056 /NEJMc1305535.
  20. Kaneko T., Colwell R.R. Ecology of Vibrio parahaemolyticus in Chesapeake Bay // J. Bacteriol. 1973. Vol. 113, N 1. Р. 24–32. doi: 10.1128/jb.113.1.24-32.1973.
  21. Бузолева Л.С., Летягина А.В., Звягинцев А.Ю., Кашин И.А. Исследование микроорганизмов, поступающих в порт Владивостока с балластными водами судов // Рос. журн. биол. инвазий. 2٠12. № 5 (1). С. 19–31.
  22. Водяницкая С.Ю., Прометной В.И., Телесманич Н.Р., Рыжков Ю.В., Лях О.В., Трут И.В., Иванова Н.Г., Кругликов В.Д., Чемисова О.С. Результаты трехлетнего мониторинга судовых балластных вод в портах Ростовской области // Пробл. особо опасных инфекций. 2014. № 2. С. 108–110. doi: 10.21055/0370-1069-2014-2-108-110.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Дендрограмма, построенная на основе кластерного анализа распределения аллелей INDEL-локусов у штаммов V. parahaemolyticus

Скачать (100KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024