INDEL-typing of strains of parahemolytic vibrions  in vitro  and  in silico

Olga S. Chemisova; Чемисова Ольга Сергеевна; Oksana A. Tsyrulina; Цырулина Оксана Алексеевна; Aleksey S. Vodopyanov; Водопьянов Алексей Сергеевич; Sergey O. Vodopyanov; Водопьянов Сергей Олегович; Margarita M. Sagakyants; Сагакянц Маргарита Мардиросовна

doi:10.31857/S0869769824020089

INDEL-typing of strains of parahemolytic vibrions in vitro and in silico

Authors: Chemisova O.S.¹, Tsyrulina O.A.², Vodopyanov A.S.², Vodopyanov S.O.³, Sagakyants M.M.³
Affiliations:
1. Don State Technical University
2. The Federal Government Health Institution Rostov-on-Don Plague Control Research Institute of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights
3. The Federal Government Health Institution Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights
Issue: No 2 (2024)
Pages: 80-89
Section: Biological Sciences
URL: https://freezetech.ru/0869-7698/article/view/676051
DOI: https://doi.org/10.31857/S0869769824020089
EDN: https://elibrary.ru/lddwqt
ID: 676051

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

The article presents the results of studying the distribution of Vibrio parahaemolyticus INDEL genotypes in the world and in Russia in vitro and in silico using the previously developed INDEL typing method based on the distribution of alleles of six loci (Vp967, Vp08, Vp619, Vp2256, VpA472, and Vp506). Among 2105 strains of V. parahaemolyticus taken in the study, 30 unique INDEL genotypes were identified, seven of which were identified as major. At the same time, geographical attachment between the genotype of parahaemolytic vibrions and the place of their isolation was revealed. The circulation of 17 INDEL genotypes was detected on the territory of the Russian Federation, the predominant of which was D2, found only in the Russian Federation. As a result, it was found that the proposed INDEL-typing method is a useful tool in conducting epidemiological investigations, which makes it possible to identify phylogenetic relationships between different isolates, which in turn makes it possible to draw conclusions about the sources of splinters of the pathogen to a specific territory.

Keywords

INDEL-typing, INDEL-loci, Vibrio parahaemolyticus, parahemolytic vibrions, genotype

Full Text

Введение

Парагемолитические вибрионы – условно-патогенные галофильные микроорганизмы семейства Vibrionaceae, обитающие в морской и эстуарной среде по всему миру [1]. Выделяются из морской воды, рыб, креветок, мидий, устриц, омаров, крабов. Способны вызывать пищевые гастроэнтериты, протекающие по типу пищевой токсикоинфекции. Основной способ передачи заключается в употреблении в пищу сырых или недостаточно термически обработанных морепродуктов [2]. В редких случаях Vibrio parahaemolyticus вызывает раневую инфекцию, ушную инфекцию или сепсис, которые могут быть опасными для жизни людей с сопутствующими заболеваниями [3].

Впервые V. parahaemolyticus идентифицирован как причина пищевой инфекции в Японии в 1950 г. [4]. С 1960–1970-х годов парагемолитические вибрионы были обнаружены в прибрежных зонах морей и океанов, а вызываемые ими заболевания начали регистрировать в странах Азии, Африки, Америки, Западной Европы и Австралии. Патогенность V. parahaemolyticus связывают с наличием генов гемолизинов – термостабильного прямого (TDH – thermostable direct hemolysin) и TDH-родственного (TDH – related hemolysin) [5]. Для штаммов парагемолитических вибрионов характерна высокая генетическая вариабельность. Появление в 1996 г. в Индии нового клона V. parahaemolyticus O3: K6 привело к первому документированному так называемому пандемическому распространению V. parahaemolyticus [6]. Характерной особенностью данных штаммов является повышенный эпидемический и патогенетический потенциал.

На территории России галофильные вибрионы широко распространены в водах Азовского, Черного, Каспийского, Балтийского и Японского морей. Крупные вспышки были отмечены на побережье Черного и Азовского морей в 1984–1986 гг., во Владивостоке – в 1997, 2001, 2002, 2007 гг., а также в пос. Славянка Хасанского района Приморского края в 2012 г. [7–9].

Расследование вспышек опасных инфекционных заболеваний требует разработки эффективных методик внутривидовой дифференциации возбудителей и поиска генетических маркеров групп штаммов, имеющих большое эпидемиологическое значение. Одним из перспективных способов генотипирования, позволяющих выявлять индивидуальные различия и филогенетические связи между штаммами, является метод INDEL-типирования, основанный на определении вставок-делеций (IN-sertion-DELetion) в различных генах [10–12]. Ранее нами был предложен метод INDEL-типирования V. parahaemolyticus на основании распределения аллелей шести локусов (Vp967, Vp08, Vp619, Vp2256, VpA472 и Vp506) и показана возможность его использования [13]. Метод удобен и, главное, позволяет уверенно проводить INDEL-типирование in silico на основании сиквенсов из международных баз данных. В связи с этим целью настоящей работы является изучение распределения INDEL-генотипов V. parahaemolyticus в мире и Российской Федерации in vitro и in silico.

Материалы и методы

В исследование in vitro было взято 122 штамма V. parahaemolyticus, выделенных из различных источников в регионах Черного, Азовского, Японского морей на территории Российской Федерации в период с 2008 по 2020 г. Культуры были получены из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, где хранились в лиофилизированном состоянии. ПЦР с сконструированными праймерами к шести INDEL-локусам вибрионов (табл. 1) проводили по ранее описанной методике [13, 14].

Таблица 1. INDEL-локусы и праймеры, использованные в работе

INDEL-локус	Размер ампликона, п. о.	Структура праймеров
INDEL-локус	Размер ампликона, п. о.	прямой	обратный
Vp967	112/94	acaaaagagcgagcactgaaac	gatccaagatgagctggaaaac
Vp08	104/89	tgaaaaactgggttaaggttgc	agacatgcccaccttgacttc
Vp619	114/92	acctgtgactgaaccagaacc	cccactgaatgaagctacctgt
Vp2256	111/99	aaaaagcggcagataatgcac	ccttatcaatggcttcttgtcc
VpA472	95/77	cgtgaactggcaagactgga	ccaatgcgatttggtaagtgtc
Vp506	85/79	aagcaccacagtcatcctgtaa	gcggtctgtagtcgtgtgaa

Виртуально in silico было изучено 1983 штамма из базы данных GenBank с известным географическим происхождением. Для анализа применяли авторское программное обеспечение Gene Expert, PrimerM и VirtualPCR, написанное на языке программирования Java. Сведения о месте и времени выделения штаммов были взяты из описания в GenBank. Кластерный анализ и построение дендрограммы проводили с использованием авторского программного обеспечения по методу UPGMA. Для построения дендрограммы использовали программу MEGA 5 [15].

Результаты

Среди включенных в исследование 2105 штаммов V. parahaemolyticus было выявлено 30 уникальных INDEL-генотипов, которые распределились между 15 кластерами, обозначенными буквами латинского алфавита с А по О (см. рисунок).

Дендрограмма, построенная на основе кластерного анализа распределения аллелей INDEL-локусов у штаммов V. parahaemolyticus

Установлено существование семи мажорных генотипов, представленных более чем 100 изолятами (С2, Н2, L2, N1, N2, O1 и O2) и 23 минорных генотипа. В табл. 2 показано географическое распределение штаммов мажорных INDEL-генотипов в мире и Российской Федерации.

Таблица 2. Свойства мажорных INDEL-генотипов V. parahaemolyticus

INDEL-генотип	Число штаммов	Распространение в мире (по анализу in silico), годы	Распространение в России (по результатам in vitro), годы
С2	252	Китай (121), 2008–2018; США (96), 2008– 2019; Перу (18), 2011–2016; Канада (7), 2008; Испания (6), 2012; Индия (1), 2014	Владивосток (3), 2019
H2	102	Китай (69), 2008–2017; США (21), 2008– 2017; Перу (5), 2015–2017; Малайзия (3), 2014; Южная Корея (2), 2014, 2015	Таганрог (1), 2015; Геленджик (1), 2020
L2	205	Китай (151), 2008–2018; США (45), 2012– 2014; Перу (2), 2009, 2017; Канада (2), 2008, 2010; Таиланд (2), 2008, 2015	Владивосток (1), 2019; Таганрог (Азовское море) (1), 2019; Новороссийск (1), 2015
N1	286	Китай (122), 2008–2019; США (94), 2009– 2018; Перу (18), 2015–2017; Канада (3), 2009, 2012–2013; Таиланд (2), 2014; Малайзия (24), 2014, 2016–2017; Чили (1), 2015; Германия (1), 2009; Вьетнам (1), 2014; Южная Корея (2), 2016, 2017; Индия (1), 2016, Мексика (2), 2019; Венесуэла (1), 2018	Приморский край (10), 2015– 2020; Азовское море (2), 2016, 2019; Черное море (2), 2012, 2020

N2	239	Китай (123), 2008–2019; США (72), 2008– 2019; Перу (12), 2015–2017; Канада (4), 2008–2010; Малайзия (2), 2009, 2017; Вьетнам (5), 2012–2014; Филиппины (1), 2015; Южная Корея (1), 2014; Мексика (1), 2014; Венесуэла (2), 2018; Испания (1), 2012; Великобритания (1), 2010	Приморский край (10), 2015– 2021; Азовское море (2), 2019; Черное море (2), 2020
O1	292	Китай (154), 2008–2019; США (79), 2008– 2019; Перу (18), 2013–2017; Канада (5), 2008, 2011–2012, 2014; Южная Корея (2), 2014; Мексика (8), 2013, 2014, 2019; Вьетнам (2), 2014; Индия (2), 2017; Венесуэла (2), 2018; Тихий океан (2), 2016	Азовское море (1), 2019; Черное море (2), 2020; Приморский край (15), 2009–2020
O2	304	Китай (126), 2008–2019; США (89), 2008– 2019; Перу (49), 2008–2011, 2014–2017; Канада (7), 2009–2015; Южная Корея (1), 2017; Малайзия (3), 2016; Англия (4), 2014, 2009, 2010; Мексика (2), 2013; Венесуэла (2), 2018; Чили (2), 2015	Азовское море (4), 2015–2019; Черное море (1), 2015; Приморский край (14), 2009–2020

При анализе in vitro INDEL-генотипов 122 штаммов, выделенных в Российской Федерации, показано наличие 17 генотипов (5 мажорных и 12 минорных). При этом 4 «мировых» мажорных генотипа (О1, О2, N1 и N2) составили более 50% (64 штамма). Однако преобладающими оказались штаммы INDEL-генотипа D2, который в мире больше нигде не встречался и был характерен только для Российской Федерации (табл. 3). При этом большинство штаммов (31) данного генотипа было выделено на территории Приморского края, из них 3 культуры от больного во Владивостоке в 2008 г. и 28 культур при вспышках в Уссурийске и пос. Славянка Хасанского района в 2012 г. И только 1 штамм INDEL-генотипа D2 был изолирован из морской воды в Таганроге в 2015 г.

Таблица 3. Мажорные INDEL-генотипы на территории Российской Федерации

Генотип	Число штаммов	Регион, год
D2	32	Славянка, 2012 (28); Владивосток, 2008 (3); Таганрог (1)
О1	18	Владивосток, 2018, 2019, 2020
О2	19	Владивосток, 2018, 2019, 2020
N1	13	Владивосток, 2021; Новороссийск, 2012
N2	14	Владивосток, 2018–2020

Обсуждение

При изучении вариабельности штаммов в соответствии с географической принадлежностью установлено, что мажорные генотипы (С2, Н2, L2, N1, N2, O1 и O2) укоренились в своих регионах (Китай и США). Это подтверждается сохранением и циркуляцией вибрионов данных INDEL-генотипов на одной территории в течение долгого времени, именно в указанных регионах выделяют преобладающее количество штаммов. Согласуется это и с литературными сведениями о том, что V. parahaemolyticus является ведущим патогеном пищевого происхождения в Китае [16] и основной причиной гастроэнтерита, вызываемого морепродуктами, в США [17]. Штаммы минорных INDEL-генотипов, как правило, были выделены из объектов окружающей среды.

Особый интерес представляет вопрос распространения патогенных микроорганизмов на другие территории. Обращает внимания факт выделения в Перу в 2009 и 2017 гг. штаммов INDEL-генотипов L2 и О2, регистрируемых до этого в Китае. Раннее исследователями [18] было показано, что вспышка, которая произошла в 2009 г. в городах Республики Перу, обусловлена изолятами V. parahaemolyticus, принадлежащими к одному клональному комплексу, прежде описанному исключительно в Азии. Это не первый случай интродукции азиатских популяций патогенного V. parahaemolyticus на Тихоокеанское побережье Южной Америки. Как предполагается, такое может быть опосредовано действием Эль-Ниньо, за счет которого область нагретых приповерхностных вод смещается к востоку [18].

Штаммы, выделенные в 2012 г. в Испании и США, отнесены к одним и тем же INDEL-генотипам C2 и N2. Генетическое сходство этих штаммов подтверждается литературными данными о том, что летом 2012 г. вспышки инфекции V. parahaemolyticus, вызванные одинаковыми серотипами, произошли на Атлантическом побережье США и Испании и были связаны с потреблением морепродуктов. На общность данных «вспышечных» штаммов, полученных от пациентов из США и Испании, указывали результаты серологических тестов, ПЦР анализа на факторы вирулентности, гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE) и метода типирования MLST. Вероятно, возможными механизмами распространения в окружающей среде и интродукции штаммов V. parahaemolyticus являются импорт и хранение живых зараженных двустворчатых моллюсков в местных водах, перенос штаммов с балластными водами на большие расстояния по океану в новые регионы. И в Нью-Йорке, и в Галисии ранее были вспышки инфекции V. parahaemolyticus, вызванной другими штаммами, что, видимо, обусловлено близостью крупных портов. Вспышки как в США, так и в Испании соответствовали во времени и пространстве более высоким, чем обычно, температурам поверхностной морской воды, что способствует увеличению распространения парагемолитических вибрионов [19].

Регистрация генотипов штаммов V. parahaemolyticus, не типичных для территорий, в отдельные годы отмечена также в Канаде, Испании, Индии и ряде других стран (табл. 2), что, вероятно, связано с заносом возбудителя на эти территории.

Стоит отметить, что штаммы, выделенные в Германии, представлены только двумя изолятами, отнесенными к генотипу N1 и L1. Штамм INDEL-генотипа N1 выделен в Германии из вод залива Балтийского моря (Килер-Фёрде) в 2009 г., а L1 – из вод Северного моря (порт Дагебюлль) в 2011 г. Отсутствие укоренения штаммов в акваториях Германии, вероятно, связано с температурой воды, которая значительно ниже по сравнению с тропическими морями. Распространение парагемолитических вибрионов в морской среде напрямую связано с температурой воды, и данный микроорганизм редко выявляется при температуре ниже 15 °, однако из-за глобального потепления на побережье Балтийского моря летом может возрасти количество инфекций, вызванных появлением в воде вибрионов [20].

Встречаемость «мировых» мажорных генотипов у штаммов, выделенных в Российской Федерации, говорит о периодических заносах этих штаммов на территорию нашей страны. Так, штаммы генотипа С2, общее количество которых составило 252 и которые в течение нескольких лет выделялись на территории США (2008–2019 гг.), Китая (2008–2018 гг.) и Перу (2011–2016 гг.), в России были обнаружены только в 2019 г. на территории Приморского края (г. Владивосток). Изоляты генотипа H2, циркулирующие в США (2008–2017 гг.), Китае (2008– 2017 гг.), Перу (2015–2017 гг.), были выделены в Таганроге в 2015 г. и Геленджике в 2020 г. Парагемолитические вибрионы генотипа L2, укоренившиеся в Китае, США и Перу, также были изолированы в Владивостоке и Таганроге только в 2019 г. и Новороссийске в 2015 г. Штаммы INDEL-генотипов N1, N2, O1, O2 оказались преобладающими среди выделенных в Российской Федерации и циркулировали в отдельных регионах в течение нескольких лет.

В результате оценки INDEL-профилей, полученных при типировании in vitro коллекционных штаммов парагемолитических вибрионов, изолированных в Российской Федерации, выявлен генотип D2, который был представлен большинством изолятов и характерен только для Приморского края Российской Федерации. Штамм данного генотипа, выделенный из воды Азовского моря у г. Таганрог, можно считать завозным.

Заключение

В ходе проведенной работы показано, что предлагаемый метод INDEL-типирования V. parahaemolyticus на основании распределения аллелей 6 локусов является полезным инструментом для изучения молекулярной эпидемиологии, позволяющим выявлять особенности территориального распределения различных генотипов штаммов, и может быть успешно использован в эпидемиологическом надзоре при расследовании вспышек заболеваний. Указанный способ INDEL-типирования эффективен при анализе результатов полногеномного секвенирования вибрионов из международных баз данных в формате in silico, а также для типирования in vitro штаммов V. parahaemolyticus, выделенных в различных регионах Российской Федерации. Было выявлено 30 уникальных INDEL-генотипов, которые на основе кластерного анализа распределились между 15 кластерами. При этом установлено существование 7 «мировых» мажорных генотипов. Среди 17 INDEL-генотипов штаммов, выделенных на территории Российской Федерации, преобладающим оказался D2, который в мире нигде больше обнаружен не был. Полученные результаты изучения генотипов штаммов V. parahaemolyticus позволяют говорить об их географической привязанности к определенной территории, а встречаемость штаммов парагемолитических вибрионов различных INDEL-генотипов в разных регионах связано с их широким распространением с балластными водами судов и по путям транспорта морепродуктов, что согласуется с литературными данными [21, 22]. Также одной из движущих сил распространения вибрионов, по-видимому, являются океанские течения.

About the authors